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飼料中的氨基酸 檢測(cè)方法包

更新時(shí)間:2016-10-21      點(diǎn)擊次數(shù):4455

 

飼料中的氨基酸 檢測(cè)方法包

杭州天釗科技有限公司

. 儀器及試劑

器:

1). 天平一臺(tái)(精度0.1mg);

2). 恒溫水浴鍋一臺(tái);

3). 容量瓶;

4). 試管(1.5×15cm1.5×10cm);

5). 微量進(jìn)樣器(5ul10µl)一支;

6). 微量可調(diào)移液槍(1000ul)一支、吸頭多個(gè);

7). 旋渦混勻器一臺(tái);

8). HPLC系統(tǒng)及氨基酸分析柱(4.6×250mm);

9). LC500梯度系統(tǒng)一臺(tái)

劑:

1). 超純水(≥18MΩ?cm);

2). 乙腈(HPLC級(jí));

3). 三水合醋酸鈉(分析純);

4). 冰醋酸(分析純);

5). 衍生試劑A和衍生試劑B溶液,至于冰箱保存(衍生試劑包對(duì)身體有害,用時(shí)請(qǐng)做好防護(hù)措施);

6). 正己烷(HPLC級(jí))。

 

二:樣品制備

準(zhǔn)確稱取飼料10-50 mg,置于25 mL具塞比色管中,加1.0 mol/L鹽酸10 mL,攪拌提取15 min,靜置10分鐘,將上清液過濾到100 mL容量瓶中,殘?jiān)?/span>1.0 mol/L鹽酸10 mL,攪拌3 min,重復(fù)提取兩次,合并上清液,收集濾液并加1.0 mol/L鹽酸定容至刻度,搖勻。

. 流動(dòng)相的配制

流動(dòng)相A 0.1mol/L醋酸鈉溶液(pH 6.5):乙睛=937

配制方法:準(zhǔn)確稱取三水合醋酸鈉13.6g1000ml水中,攪拌均勻,使之溶解,用冰醋酸或氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至6.5;準(zhǔn)確量取配制好的三水合醋酸鈉溶液465ml和乙腈35ml,混合均勻,抽濾過0.45µm濾膜; 

流動(dòng)相B水:乙腈=2080

配制方法:準(zhǔn)確量取水100ml和乙腈400ml,混合均勻,抽濾過0.45µm濾膜;

 

. 衍生化反應(yīng)

1. 對(duì)照品溶液的制備

17種氨基酸對(duì)照品溶液用水稀釋至原來濃度的1/10倍稀釋作為對(duì)照品。

17種氨基酸對(duì)照品溶液稀釋10倍后,各氨基酸的濃度為:

Name

M.W.

C(mmol/L)

C(mg/ml)

Name

M.W.

C(mmol/L)

C(mg/ml)

門冬氨酸

133.10

0.25

0.03328

胱氨酸

240.30

0.125

0.03004

谷氨酸

147.13

0.25

0.03678

纈氨酸

117.15

0.25

0.02929

絲氨酸

105.09

0.25

0.02627

氨酸

149.21

0.25

0.03730

甘氨酸

75.067

0.25

0.01877

異亮氨酸

131.17

0.25

0.03279

組氨酸

155.15

0.25

0.03879

亮氨酸

131.17

0.25

0.03279

精氨酸

174.20

0.25

0.04355

酪氨酸

181.19

0.25

0.04530

蘇氨酸

119.12

0.25

0.02978

苯丙氨酸

165.19

0.25

0.04130

丙氨酸

89.093

0.25

0.02227

賴氨酸

146.19

0.25

0.03655

脯氨酸

115.13

0.25

0.02878

 

 

 

 

2. 供試品溶液制備

精密量取/稱取供試品適量,并配制成相應(yīng)濃度的溶液備用。

3. 衍生步驟

1)將恒溫水浴鍋預(yù)熱至50±1;

2)分別將AB兩種衍生試劑用稀釋劑稀釋至原來濃度的1/5倍;

3)精密量取上述對(duì)照品溶液1ml,置于試管中,加入稀釋后的A溶液0.5ml和稀釋后的B溶液0.5ml,搖勻;在50±1℃水浴中加熱45分鐘,取出,加入正己烷溶液1ml,振搖;并用孔徑為0.45μm有機(jī)膜過濾,放置30分鐘后,取澄清的下層液進(jìn)行分析試驗(yàn);

4)供試品的衍生步驟與對(duì)照品相同;

 

. 色譜條件

1. 色譜柱:Ultimate® AA5μm4.6×250mm;

2. 梯度程序

流動(dòng)相A 0.1mol/L醋酸鈉溶液(pH 6.5):乙睛=937

流動(dòng)相B 水:乙腈=2080

T(min)                    A%                          B%

0.01                     100.0                      0.0

11                        93.0                      7.0

13.9                      88.0                       12.0

14                        85.0                       15.0   

29                        66.0                       34.0

32                        30.0                     70.0

35                         0.0                    100.0

42                         0.0                    100.0

45                       100.0                      0.0  

60                       100.0                      0.0

流 速:1.0ml/min

柱 溫:40

   長(zhǎng):254nm

 進(jìn)樣量:5μl

 工作站記錄時(shí)間:60min

色譜圖:

. 操作步驟和注意事項(xiàng)

1. 操作步驟:

1)設(shè)置柱溫40和流速1.0ml/min

2)將A、B兩個(gè)通道用乙腈:水=2080排盡氣泡(如B通道的原存留液中不含緩沖鹽,則無需用乙腈:水=2080排氣泡),B通道用流動(dòng)相B再排盡氣泡;

3)用乙腈:水=2080A通道)沖洗系統(tǒng)20min,以防止緩沖鹽析出;

4A通道用流動(dòng)相A排盡氣泡,然后用流動(dòng)相A走基線30min,平衡色譜柱;

5)運(yùn)行一次空白梯度;

6)進(jìn)樣分析;

7) 分析完成后:

I)用乙腈:水=2080代替流動(dòng)相A,進(jìn)水樣(清洗自動(dòng)進(jìn)樣器),進(jìn)行梯度洗脫;

II)換90%乙腈沖洗色譜柱40min以上;

2. 注意事項(xiàng):

1)進(jìn)樣分析:先進(jìn)對(duì)照品溶液,后進(jìn)供試品溶液;

2)緩沖溶液,隔天需重新配制;

3)防止緩沖鹽析出。

  氨基酸方法包,主要包括:

產(chǎn)品名稱

備注

LC500液相色譜儀梯度系統(tǒng)一套

天平一臺(tái)(精度0.1mg

 

恒溫水浴鍋一臺(tái)

 

容量瓶

 

試管(1.5×15cm1.5×10cm

 

微量進(jìn)樣器(100µl)一支

 

微量可調(diào)移液槍(1000ul)一支、吸頭多個(gè)

 

旋渦混勻器一臺(tái)

 

HPLC 2000色譜工作站

 

氨基酸分析柱(4.6×250mm

 

超純水(≥18MΩ?cm

 

Welpure 乙腈 4*4LHPLC級(jí))

 

三水合醋酸鈉(分析純)

 

冰醋酸(分析純)

 

Welpure正己烷 4*4LHPLC級(jí))

 

衍生試劑A,1瓶,10ml/

 

衍生試劑B,1瓶,10ml/

 

氨基酸衍生試劑稀釋劑,6瓶,10ml/

 

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,2瓶,1ml/

 

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